| MS Comment of details
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[column] TSK-gel ODS-100V (4.6 x 250 mm, 5 … [column] TSK-gel ODS-100V (4.6 x 250 mm, 5 micrometer; TOSOH)
[gradient] Solvent A: water containing 0.1% v/v formic acid; Solvent B: acetonitrile containing 0.1% v/v formic acid; Gradient: 3% B (0 min), 97% B (90 min), 97% B (100 min), 3% B (100.1 min), and 3% B (107 min)
[total separation time] 107 min (107 min)
[total separation time] 107 min
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| MS Description
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Metabolite Extraction
Compounds in foods … Metabolite Extraction
Compounds in foods were extracted by approximately 75%(v/v) methanol. In the case of liquid samples and powders from foods containing abundant water (such as vegetables), 3 times volume (v/v or w/v) of 100% methanol were added. In the case of samples with low water content (such as dried seaweed), 400 times volume (w/v) of 75% methanol were added. We did not measure the moisture content of each food. A 25 µM of 7-hydroxy-5-methylflavone is contained as internal standard (IS) in the added methanol. The sample in methanol in 2 mL tubes was homogenized using Mixer Mill MM 300 (QIAGEN) at 25 Hz, for 2 min, twice. A homogenate was centrifuged under 17,400 x g, 5 min at 4 ºC. A supernatants was passed through a Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter (pore size 0.2 µm, Millipore), and a filtrate was applied to a C18 silica column (MonoSpin C18, GL Science) to remove highly-hydrophobic contaminants. The filtrate passed through the C18 column was used for LC-MS analyzes.
The same extraction procedure were performed using 75%(v/v) methanol without sample to prepare mock samples and used as negative controls.
Liquid chromatography (LC)-mass spectrometry (MS) analysis
Agilent 1100 system (Agilent) and Finnigan LTQ-FT (Thermo Fisher Scientific) were used. Aliquots (20 µL) of the methanol extract were applied to a TSK-gel ODS-100V column (4.6 x 250 mm, 5 µm, TOSO), and separated by water containing 0.1%(v/v) formic acid (Solvent A) and acetonitrile containing 0.1%(v/v) formic acid (Solvent B). The gradient program was as follows: 3% B (0 min), 97% B (90 min), 97% B (100 min), 3% B (100.1 min), and 3% B (107 min). The flow rate was set at 0.25 mL/min for 0-100 min, and 0.5 mL/min for 100.1-107 min. The column oven temperature was set to 40 ºC. To monitor the HPLC eluate, a photodiode array detector was used with a wavelength range of 200-650 nm.
Electrospray ionization (ESI)-negative mode with a spray voltage of 4.0 kV and capillary temperature of 300 ºC was used for compound detection. The nitrogen sheath gas and auxiliary gas were set at 40 and 15 arbitrary units, respectively. The MS scan setting was as below:
- Method 1
A setting for measurement of accurate mass and for obtaining MS/MS spectra.
Full scan: Resolution = 100,000 by Fourier-transform ion cyclotron resonance (FT) MS
MS2 scan: Data dependent scan by ion trap (IT) MS for the most intense 5 ions in the full scan
The dynamic exclusion settings for MS2 scan was follows: repeat count, 3; repeat duration, 30s; exclusion list size, 500; margin, 10 ppm, exclusion duration, 20s. A m/z range for Full scan was set to 100-1500. Raw data were obtained by Xcalibur software (ver. 2.0.7, Thermo Fisher Scientific).
[Japanese]
化合物の抽出
終濃度約75%(v/v)のメタノールで抽出した。液体や含水率の高い葉野菜などの試料は、3倍容または3倍量の100%メタノールを添加した。のりなどの乾燥した試料は、75%メタノールを加えた。なお、正確な含水率は測定していない。また、用いたメタノールには、質量分析での内部標準として、25μMの7-ヒドロキシ-5-メチル フラボンを添加した。メタノールを添加した試料を、Mixer Mill MM 300 (QIAGEN社)にて、25 Hz, 2 min, 2回の条件で激しく撹拌し、その後、 17,400×g, 5 min, 4℃で遠心分離した。遠心上清を、ポアサイズ0.2μmのポリテトラフルオロエチレン（PTFE） フィルター（Millipore社）で濾過して微粒子を除去したあと、濾液をC18シリカカラム（MonoSpin C18、 GLサイエンス社）に通して疎水性の強い成分を吸着除去した。C18カラムを通過した試料を、液体クロマトグラフィー- 質量分析に供試した。
試料を含まない75%メタノール抽出液で、全く同じ処理を行ったもの（mockサンプル）を準備し、 ネガティブコントロールとして用いた。
液体クロマトグラフィー-質量分析
液体クロマトグラフィーとしてAgilent 1100システム（Agilent社）、その下流に接続した質量分析器として Finnigan LTQ-FT（Thermo Fisher Scientific社）を用いた。上記までに調製したメタノール抽出試料20μLを、LC装置に接続したTSK-gel ODS-100Vカラム（4.6×250 mm, 5μm, 東ソー社）にロードし、溶媒A（0.1%(v/v)ギ酸を含む HPLCグレードの水）と溶媒B（0.1%(v/v)ギ酸を含むHPLCグレードのアセトニトリル）によるリニアグラジエントにより分離した。グラジエントプログラムは、3% B (0 min), 97% B (90 min), 97% B (100 min), 3% B (100.1 min), 3% B (107 min)とした。流速は、0-100 minの分離時間が0.25 mL/min、100.1-107 minのウォッシュ時間が0.5 mL/minとした。流速は0.25 mL/min (0-100 min)、0.5 mL/min (100.1-107 min)とした。カラムオーブン温度は40℃とした。HPLCによる溶出をモニタするため、UV/Vizフォトダイオードアレイ検出器により200-650 nmの吸収波長を測定した。
エレクトロスプレーイオン化法（ESI）ネガティブモードにより化合物を検出した。スプレイ電圧は4.0 kV、キャピラリー温度は300℃とした。窒素シースガスおよび補助ガスは、それぞれ40および15ユニットに設定した。以下のスキャン条件を設定した。
- Method 1
成分の精密質量を得ながら、多くのMS/MSスペクトルを取得する条件設定
フルスキャン： 分解能100,000 フーリエ変換型質量分析(FT)
MS2スキャン： フルスキャンで得た強度の強い上位5つのイオンについて、イオントラップ型質量分析(IT)
MS2取得時のダイナミックエクスクルージョン設定は以下とした： repeat count, 3; repeat duration, 30 s; exclusion list size, 500; margin, 10 ppm; exclusion duration, 20 s。フルスキャンの検出レンジはm/z 100-1500とした。データの取得はXcaliburソフト（バージョン2.0.7、Thermo Fisher Scientific）にて行った。 バージョン2.0.7、Thermo Fisher Scientific）にて行った。
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